Yazdır

KLİNİK ?ALIŞMA
RESEARCH ARTICLE

Doi: 10.5578/tt.67376
Tuberk Toraks 2018;66(3):234-238

Geliş Tarihi/Received: 04.09.2018 • Kabul Ediliş Tarihi/Accepted: 21.09.2018

K?lt?r ile kanıtlanmış akciğer dışı t?berk?loz: ila? duyarlılığı ve genetik profil analizi

Mehmet Sezai TAŞBAKAN1, Damla AKDAĞ2, Hasip KAHRAMAN3, Deniz AKYOL2, Meltem TAŞBAKAN2, Cengiz ?AVUŞOĞLU4

1 Ege ?niversitesi Tıp Fak?ltesi, G?ğ?s Hastalıkları Anabilim Dalı, İzmir, T?rkiye

1 Department of Chest Diseases, Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey

2 Ege ?niversitesi Tıp Fak?ltesi, İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, T?rkiye

2 Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey

3 Dat?a Devlet Hastanesi, İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği, Muğla, T?rkiye

3 Clinic of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, Datca State Hospital, Mugla, Turkey

4 Ege ?niversitesi Tıp Fak?ltesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, T?rkiye

4 Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Ege University, Izmir, Turkey

?ZET

K?lt?r ile kanıtlanmış akciğer dışı t?berk?loz: ila? duyarlılığı ve genetik profil analizi

Giriş: T?berk?loz genel olarak akciğerlerde g?r?lmekle birlikte t?m organları etkileyebilmektedir. Ancak akciğer dışı tutulum olduğunda tanı koymak, akciğer tutulumundan daha zordur. Mycobacterium tuberculosis'in izole edilmesi, ekstrapulmoner t?berk?loz (EPTB) tanısında altın standart olmasına karşın, ?zellikle EPTB'de bakteriyolojik izolasyon oranı d?ş?kt?r. Eğer M. tuberculosis elde edilebilirse, hastalığın epidemiyolojik ?zellikleri ve ila? duyarlılığı hakkında bilgi vermektedir.

Materyal ve Metod: Bu ?alışmada, 2009-2016 yılları arasında mikobakteriyoloji laboratuvarında M. tuberculosis izole edilen ekstra pulmoner ?rnekler değerlendirilmiştir. İzole edilen bakterilerin genotiplerin belirlenme işlemi ve ila? duyarlılık testleri yapılmıştır. Spoligotipleme, daha ?nce tarif edilen standart bir teknik kullanılarak ger?ekleştirilmiştir.

Bulgular: ?alışma s?resince 165 hastaya ait 171 ekstrapulmoner ?rnekte M. tuberculosis (75 erkek, 90 kadın, ortalama yaş: 53.35 ? 19.92) k?lt?rde ?retilmiştir. Birden fazla ekstrapulmoner organ tutulumu 6 hastada mevcuttur. En yaygın EPTB şekli 60 hastada lenf nodu, 32 hastada plevral t?berk?loz ve 25 hastada kemik t?berk?lozdur. Yedi hasta insan imm?n yetmezlik vir?s?yle infekte olmak ?zere 44 hastada imm?n yetmezlik saptanmıştır. T?berk?loz ila? direnci 175 ?rneğin 21'inde tespit edilmiştir. Rifampisin direnci 7 ?rnekte, y?ksek d?zeyde izoniazid direnci 11 ?rnekte ve rifampisin ve izoniazid direnci (?oklu ila? direnci) 6 ?rnekte g?sterilmiştir. T?berk?loz hastalarının farklı ?rneklerinden elde edilen 135 klinik izolatın genetik profili Spoligotyping kullanılarak belirlenmiştir. Maj?r Spoligotipler, T (n= 62; %45.9), LAM7-TUR (ST41) (n= 11; %8.1) ve H1 (n= 9; %6) genotipleridir.

Sonu?: En yaygın EPTB şekli, k?lt?rle kanıtlanmış hastalarda lenf nodu t?berk?lozudur. Bu hasta grubunda, ?oklu ila? direnci oranı d?ş?kt?r (%3.6). Spoligotip T (%45.9) en sık g?r?len genetik profil olarak tespit edilmiştir.

Anahtar kelimeler: T?berk?loz; spoligotipleme; ila? duyarlılığı

SUMMARY

Culture proven extra pulmonary tuberculosis: drug susceptibility and genetic profile analysis

Introduction: Tuberculosis is seen generally in the lungs. Besides, all organs in the body can be affected by tuberculosis. Diagnosis of extra pulmonary tuberculosis (EPTB) is more difficult than pulmonary tuberculosis (PTB). Although, the isolation of Mycobacterium tuberculosis is gold standard of diagnosis of EPTB, the rate of bacteriologic isolation is low especially in EPTB. If M. tuberculosis is detected, it gives some information about the epidemiological features of the disease and drug susceptibility.

Materials and Methods: In this study, extra pulmonary samples isolated M. tuberculosis in mycobacteriology laboratory were evaluated between 2009-2016. The identification of the genotype of isolated bacteria and drug sensitivity tests were conducted. Spoligotyping was accomplished using a standard technique as described previously.

Results: During the study period, M. tuberculosis were cultured in 171 extra pulmonary samples of 165 patients (75 male, 90 female, mean age: 53.35 ? 19.92). Initial direct microscopically examination was revealed M. tuberculosis in 44 patients.? There were more than one extra pulmonary organ involvement in six patients. The most common EPTB forms were lymph node TB in 60 patients, pleural tuberculosis in 32 patients and bone tuberculosis in 25 patients. Immunosuppression was detected in 44 (%26.6) patients. Among these, seven patients were infected with HIV. In 21 of 175 samples, drug resistance was detected.? Rifampicin resistance in 7 samples, high level isoniazid resistance in 11 samples and rifampicin plus isoniazid resistance (multiply drug resistance) in 6 samples were demonstrated. One hundred thirty-five clinical isolates were cultured from tuberculosis patient's different samples, of which the genetic profile was determined by using Spoligotyping. The major Spoligotypes were T (n= 62; 45.9%), LAM7-TUR (ST41) (n= 11; 8.1%) and H1 (n= 9; 6%) genotypes.

Conclusion: The most common EPTB form was lymph node tuberculosis in culture proven patients. In these patients group, multiply drug resistance rate was low (3.6%). Spoligotypes T (45.9%) was detected as most common genetic profile.

Key words: Tuberculosis; spoligotyping; drug susceptibility

Geliş Tarihi/Received: 04.09.2018 - Kabul Ediliş Tarihi/Accepted: 21.09.2018

GİRİŞ

T?berk?loz başlıca akciğer ve plevrayı tutmakla birlikte, v?cuttaki her organı etkileyebilen bir hastalıktır (1). Akciğer dışında yerleşen ve ekstrapulmoner t?berk?loz (EPTB) adı altında toplanan, ?eşitli doku ve organların t?berk?lozu, sinsi olarak ilerleyerek birincil infeksiyondan yıllar sonra ortaya ?ıkabileceği gibi hızlı ilerleyerek akut bir tabloya da neden olabilmektedir (2). Sağlık Bakanlığı'nın T?rkiye'de Verem Savaşı 2017 Raporu verilerine g?re 2015 yılında 12.772 olgu t?berk?loz tanısı almıştır (3). Hastaların 7598‘inde (%59.5) akciğer tutulumu, 4548'inde (%35.6) akciğer dışı organ tutulumu saptanırken 626 (%4.9) hastada hem akciğer hem de akciğer dışı tutulum g?sterilmiştir (3). ?lkemizde 2005 yılı verilerinde akciğer dışı t?berk?loz oranının? %28.6 (n= 5359)‘dan 2015‘de %35.6 (n= 4548)‘ya ulaşması EPTB olgularında sayısal artma olmamakla birlikte t?m t?berk?loz hastaları i?erisinde y?zdelik oranın arttığını g?stermektedir (3).

T?berk?loz tanısında altın standart k?lt?rde etkenin ?retilmesidir. Ancak EPTB‘de tanı akciğer t?berk?lozundan daha zordur. ??nk? etken i?in ?rnekleme yapmak veya etkeni izole etmek her zaman m?mk?n olamamaktadır. K?lt?rde Mycobacterium tuberculosis'in ?retilmesi kesin tanı koymayı sağlamakla birlikte, s?rveyans ve ila? duyarlılığı ?alışmalarının yapılmasınada imkan sağlayabilmektedir. K?lt?rde etkenin saptanmasının bir avantajı ise korunma ve kontrole y?nelik programların geliştirilmesinde farklı t?r ve genotiplerin ortaya ?ıkarılmasına yol a?abilmesidir (4). Molek?ler d?zeyde yapılan s?rveyansda; IS6110-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) spoligotiplendirme ve 12-15-24 lokuslu MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetetive Units-Variable Number of Tandem Repeat) y?ntemleri veya bu y?ntemlerin kombinasyonları kullanılabilir (4). En yaygın kullanılan y?ntem spoligotiplendirmedir.

Bu ?alışmada hastanemiz mikobakteriyoloji laboratuvarına g?nderilen solunum ?rnekleri dışındaki ?rneklerden M. tuberculosis ?reyen hastaların retrospektif olarak irdelenmesi, antit?berk?loz ila? duyarlılık ve genotiplerinin değerlendirilmesi ama?lanmıştır.

MATERYAL ve METOD

Bakteri İzolatları

Hastanemiz Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Mikobakteriyoloji Laboratuvarı‘na 2009-2016 yılları arasında rutin mikobakteriyolojik inceleme amacıyla g?nderilen ekstrapulmoner ?rneklerden ?retilen ve GenoTypeMTBDRplus (Hain-Life Science) kitiyle M. tuberculosis kompleks olarak tanımlanan izolatlar ?alışmaya alındı. MGIT 960TB (BD Diagnostic, ABD) y?ntemiyle izole edilen suşlarının antit?berk?loz ila? direnci de aynı y?ntemiyle belirlendi.

Olgular

M. tuberculosis izole edilen ekstrapulmoner t?berk?loz tanısı alan olgular laboratuvarı kayıtlarından ve hastane veri tabanında kayıtlı hasta dosyalarından retrospektif olarak tarandı. Olguların yaşı, cinsiyeti, ek hastalıkları, infeksiyon odağı, anti-t?berk?loz ila? diren?leri ve genotiplendirmeleri irdelendi.

İzolatların Genotiplendirmesi

Bu ama?la spoligotiplendirme y?ntemi kullanıldı. Uygulama spoligotiplendirme i?in hazırlanmış kit (Spoligotyping Kit; Isogen Life Science, Hollanda) ?reticisinin tanımladığı şekilde ger?ekleştirildi. Kısaca; k?lt?rde ?retilen izolatlardan elde edilen DNA'nın 5 ?L'si polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) işleminde kalıp DNA olarak kullanıldı. DR dizisini hedef alan biyotinle işaretli primerler kullanılarak DR b?lgeleri arasındaki "spacer"lar amplifiye edildi. Amplifiye olmuş PCR ?r?n? mini blotter yardımıyla oligon?kleotit bağlı bulunan nitrosel?loz membran ile hibridize edildi. Membranla hibridize olmuş "spacer"lar HRP-konjugat ve substratla ink?be edildikten sonra membran X-Ray filmiyle muamele edildi ve hibridize olan "spacer"lar karecikler olarak g?r?n?r hale getirildi. Hibridize olmuş "spacer"in varlığı pozitif sinyal, "spacer" hibridizasyonunun olmaması ise negatif sinyal olarak değerlendirildi. Suşların spoligotip numaraları, ait olduğu k?me ve aileler http://www.pasteur-guadeloupe.fr veri tabanı kullanılarak belirlendi.

Duyarlılık Testleri

Duyarlılık testleri BACTEC MGIT 960 (BD Spark, ABD) otomatize sıvı sistemi kullanılarak yapıldı. Diren? sınır değerleri rifampisin i?in 1.0 ?g/mL, izoniyazid i?in 0.1 ?g/mL, streptomisin i?in 1.0 ?g/mL ve etambutol i?in 5.0 ?g/mL olarak kabul edildi (5).

BULGULAR

?alışmanın yapıldığı d?nemde 165 (75 erkek), yaş ortalaması: 53.35 ? 19.92 (min: 2, max: 92) hastadan 171 ?rnekte M. tuberculosis ?remesi saptanmıştır. Kırk d?rt hastada direkt mikroskopik incelemede asido rezistan basil g?r?lm?şt?r. En yaygın EPTB formu 60 hastada (%36.3) lenf nodu, 32 hastada (%19.3) plevral t?berk?loz ve 25 hastada (%15.1) kemik t?berk?lozuydu (Tablo 1). Altı hastada birden fazla organ tutulumu vardı. Hastaların ikisinde akciğer birinde deri t?berk?lozu olmak ?zere ?? hastada ge?irilmiş t?berk?loz ?yk?s? bulunmaktaydı. Hastaların 44'?nde altta yatan imm?ns?presyon tespit edildi. Sırasıyla 11 hastada diyabet, 10 hastada kronik b?brek yetmezliği, 8 hastada imm?ns?presif tedavi alan romatolojik hastalık, 8 hastada hematolojik malignite, 7 hastada solid organ malignitesi, 7 hasta insan imm?n yetmezlik vir?s?yle infekte ve 4 hastada b?brek nakli ?yk?s? bulunmaktaydı. K?lt?rde ?reme saptanan 171 ?rneğin 21'inde ila? direnci tespit edildi. Yedi ?rnekte rifampisin, 11 ?rnekte y?ksek d?zeyde izoniazid ve 6 ?rnekte rifampisin ve izoniazid direnci (ila? direnci ?oğalması) g?sterilmiştir.


Tablo 1

Y?z kırk dokuz klinik ?rnekte genetik profili Spoligotyping kullanılarak belirlenmiştir. Maj?r Spoligotipler T (n= 62, %45.9), Lam7Tur (n= 11, %8.1) ve H1 (n= 7,? 6.6%) genotipleridir. T spolipotipi saptanan 62 hastanın 39'u kadındır. En ?ok g?r?len tipler ve cinsiyet dağılımları Tablo 2'de verilmiştir.


Tablo 2

TARTIŞMA

?lkemizde t?berk?loz g?r?lme sıklığı son yıllarda azalmasına rağmen, bu olgular i?indeki EPTB oranı yıllara g?re artış g?stermeye devam etmektedir (3). Ekstra pulmoner t?berk?loz sıklığı %8-24 arasında değişmekle birlikte imm?n yetmezlikli kişilerde %12.1-%48.5 arasında daha y?ksek oranlarda g?r?lebilmektedir (6,7). ?alışmamızda da olguların %26.6'sında imm?n yetmezlik mevcuttu. T?berk?loz verem savaşı 2017 raporundaki EPTB'lerin dağılımına benzer olarak bizim olgularımızda da en sık tutulan b?lgeler lenf nodu ve plevral t?berk?lozdur, ?lkemizde bu iki tutulumdan sonra en sık gastrointestinal-periton t?berk?loz g?r?l?rken, ?alışmamızda kemik t?berk?lozu ???nc? sıklıkta g?r?lm?şt?r. Akciğer dışı t?berk?lozu olan 257 olgunun değerlendirildiği bir ?alışmada, en sık lenf nodu, plevra ve kemik-eklem t?berk?loz g?r?ld?ğ? belirtilmiştir (8).

Diren?li t?berk?loz olguları halk sağlığı a?ısından d?nya ?apında endişe yaratmaya devam etmektedir (9). T?berk?loz direnci tanımına bakıldığında, tek ilaca diren?li t?berk?loz (rifampisin veya izoniazide), birden ?ok ilaca diren?li t?berk?loz (rifampsin ve izoniazid direnci beraber olmamak kaydıyla en az iki birinci basamak ilaca), ?oklu ilaca diren?li olgular (rifampisin ve izoniazide), yaygın ila? direnci (rifampisin ve izoniazide ek, anti-TB ila?lardan herhangi bir florokinolona ve parenteral kullanılan anti-TB ila?lardan en az birine) karşı gelişen direnci ifade etmektedir (10). Diren?li t?berk?lozun tedavisinde kullanılan ikinci basamak ila?lar, birinci basamak ila?lara g?re daha toksik, etkinlikleri daha d?ş?k ve maliyetleri daha y?ksektir. Bu olguların tedavilerinin daha zor olması, tedavi ve hastanede yatış s?relerinin uzun olması bu olguların klinik olarak ?nemini arttırmaktadır (11). T?rkiye'de Verem Savaşı 2017 raporunda t?m olguların %21.3'?nde en az bir ilaca diren? saptanmıştır (3). İla? direnci bakılan olgularda izoniazid direnci %13.7, rifampisin direnci %5.4, izoniazid ve rifampisin direnci ise %4.1 olarak tespit edilmiştir (3). Olgularımızda izoniazid direnci %6.3, rifampisin direnci %4, ?oklu ila? direnci ise %3.4 oranında saptanmıştır. İzoniazid direnci ?lke verilerine g?re d?ş?k bulunmakla birlikte rifampisin ve ?oklu ila? diren?leri benzer bulunmuştur.

T?berk?lozun toplum i?erisindeki yayılımının değerlendirilmesi nedenlerinin anlaşılması ve daha etkili kontrol ?nlemlerinin geliştirilebilmesi i?in molek?ler bazlı epidemiyolojik y?ntemlerin yaygınlaşması gerekmektedir (4). ?ukurova b?lgesinde yapılan ?alışmada akciğer t?berk?lozlu olgulardan toplanan 467 ?rnek değerlendirilmiş, 239 (%51.9) izolatta T1 ailesi, 54 (%11.5) izolatta ise LAM7 TUR ailesi tespit edilmiş (4). Ankara ve Malatya b?lgesine ait 245 ?rneğin değerlendirildiği diğer bir ?alışmada %21 LAM7 TUR, %16.3 T1, %5.3 oranında Haarlem 3 ailesi saptanmış (12). Malatya b?lgesinden diğer bir ?alışmada 450 M. tuberculosis izolatı değerlendirilmiş; T ailesi %38.6, LAM7 TUR %27.3, Haarlem ailesi ise %14.8 oranında g?r?lm?şt?r (13). Bizim ?alışmamızdaki Maj?r Spoligotipler, T, Lam7-TUR ve H1 genotipleridir. T tipi dışındakilerde kadın erkek oranı benzer olmakla birlikte T tipinde kadın hasta oranı y?ksek bulunmuştur. Ancak diğer tiplerde hasta sayısının az olması nedeniyle bu konuda ayrıntılı yorum yapılamamaktadır.

SONU?

Bu ?alışma k?lt?r pozitif ADTB olgularında diren? ve genotip d?zeyinde değerlendirmeyi irdeleyen en geniş ?alışmalardan biridir. B?lgemizdeki t?berk?loz suşlarının dağılımı hakkında epidemiyolojik veriler elde edilmiştir. ?alışmamızın kısıtlılıklarını değerlendirdiğimizde, ?alışmanın retrospektif olarak planlanması, toplanan ?rneklerin İzmir ve ?evresiyle sınırlı olması ve hasta takiplerinin tanı konulduktan sonra başka merkezlerde yapılması nedeniyle sağkalımları ile ilgili bilgi edinilememesi sayılabilir. ?lkemizdeki t?berk?loz suşlarının genetik dağılımına ait epidemiyolojik verilerin artması ve bu verilerin yıllar i?indeki değişimlerinin izlenmesiyle, hastalığın kontrol altında tutulabilmesi ve diren?li t?berk?loz olgularının yayılımının ?nlenmesi sağlanabilir.

KAYNAKLAR

  1. Taşbakan MS, Pulluk?u H, Sipahi OR, Işıkg?z Taşbakan M, Ozk?ren ?alık S, Yamazhan T. Evaluation of 694 tuberculous lymphadenitis cases reported from Turkey between 1997-2009 period by pooled analysis method. Mikrobiyol Bul 2010;44:385-93.
  2. Aslan G, ?lger M, Delialioğlu N, Otağ ZF, D?şmez Apa D, Ers?z G, et al. Mersin ilindeki akciğer dışı t?berk?loz olgularının mikrobiyolojik ve demografik olarak değerlendirilmesi. T?rk Mikrobiyol Cem Derg 2017;47:197-204.
  3. T?rkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı T?rkiye'de Verem Savaşı 2017 Raporu.? https://hsgm.saglik.gov.tr/depo/haberler/verem-savas-raporu-2016 2017/Turkiyede_Verem_Savasi_2017_Raporu.pdf
  4. Zeytinli U, K?ksal F. Genotyping of Mycobacterium tuberculosis strains isolated from pulmonary tuberculosis patients in Cukurova Region, Turkey by spoligotyping and MIRU-VNTR methods. Mikrobiyol Bul 2012;46:202-10.
  5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae, and other aerobic Actinomycetes. Approved Standard M24-A2, Second Edition. CLSI, Wayne, PA, 2011.
  6. Naing C, Mak JW, Maung M, Wong SF, Kassim AIBM. Meta-analysis: the association between HIV infection and extrapulmonary tuberculosis. Lung 2013;191:27-34.
  7. World Health Organization World Health Organization Global? Tuberculosis Report,? 2018. Available from: http://www.who.int/tb/publications/global_report/archive/en/
  8. Sunnetcioglu M, Baran AI, Binici I, Esmer F, Gultepe B. Evaluation of 257 extra pulmonary tuberculosis cases at the Tuberculosis Control Dispensary, Van, Turkey. J Pak Med Assoc 2018;68:764-7.
  9. Prasad R, Kumar Srivastava D. Multi drug and extensively drug-resistant TB (M/XDR-TB) management: Current issues. Clinical epidemiology and global health 2013;1:124-28.
  10. Caminero JA, Sotgiu G, Zumla A, Migliori GB. Best drug treatment for multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis 2010;10:621-9.
  11. Baylan O. ?ok ilaca diren?li t?berk?lozdan sonra yaygın ilaca diren?li ve t?m ila?lara diren?li t?berk?loz formları: eski hastalığın yeni y?zleri. Mikrobiyol Bul 2011;45:181-95.
  12. Zozio T, Allix C, Gunal S, Saribas Z, Alp A, Durmaz R, et al. Genotyping of mycobacterium tuberculosis clinical isolates in two cities of Turkey: description of a new family of genotypes that is phylogeographically specific for Asia Minor. MC Microbiol 2005:26;5:44.
  13. G?nal S. T?rkiye'nin farklı coğrafik b?lgelerinden toplanan Mycobacterium tuberculosis izolatlarının ıs6110 rflp (restrıctıon fragment length polymorphısm) ve spoligotip profillerinin belirlenmesi (tez). Malatya: İn?n? ?niversitesi, 2006.

Yazışma Adresi (Address for Correspondence)

Dr. Meltem TAŞBAKAN

Ege ?niversitesi Tıp Fak?ltesi,

İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,

İZMİR - T?RKİYE

e-mail: tasbakan@yahoo.com

Yazdır